В конце XV - начале XVI веков с Кирилловым и другими заволжскими монастырями тесно связана группировка сторонников монастырского "нестяжания" (отказа от владениями селами), полагавшая, что иноки, посвятившие себя Богу, не должны пользоваться трудом чужих рук и "кормиться" собственным "рукоделием". На церковном соборе 1503 года нестяжатели потерпели поражение, однако ожесточенная борьба между враждующими партиями внутри русской церкви вокруг вопроса о монастырском землевладении еще долго не ослабевала. Хотя Кириллов монастырь, обладавший огромным вотчинным хозяйством, никогда не проводил на практике идей нестяжания, из него вышли и в нем подвизались многие крупнейшие деятели этого движения. Среди них - глава первых нестяжателей Нил Сорский, постриженик Кирилло-Белозерского монастыря. После пребывания на Афоне, где он приобрел обширные богословские звания, Нил возвратился в Белозерье и основал свой скит посреди непроходимых лесных болот, в 20 км к северу от Кириллова. Влияние проповеди Нила Сорского, видевшего в монашестве прежде всего подвиг личного нравственного совершенствования, было особенно велико среди братии северных монастырей. Один из видных нестяжателей, Гурий Тушин, некоторое время был игуменом Кирилло-Белозерского монастыря. Монастырь в ХV-ХVI веках пользовался большим влиянием, а его настоятель входил в число высших церковных иерархов.
Особо большое внимание московские правители уделяли монастырю в XVI столетии. В 1528 году великий князь Василий III ездил в далекий Кириллов монастырь с княгиней Еленой Глинской молиться о даровании наследника. Последовавшее за этим рождение сына - будущего царя Ивана Грозного - в глазах современников связывалось с заступничеством преподобного Кирилла. Известно, что Грозный на протяжении всей своей жизни питал к монастырю особое пристрастие, трижды посещал его, делал богатые вклады (только деньгами более 24 тысяч рублей). Перед смертью принимая схиму, он, как и его отец Василий III, стал пострижеником Кириллова монастыря.
Растущее богатство монастыря позволило ему развить бурную строительную деятельность. Уже к концу XVI века за каких-нибудь сто лет на месте деревянных монастырских строений возник один из крупнейших по тому времени архитектурных комплексов, по количеству каменных зданий сопоставимый только с наиболее почитаемым монастырем - Троице-Сергиевым. Несколько уступая ему протяженностью каменных стен (585 саженей), он превосходил его числом храмов. Вновь сооружаемые церкви богато украшались иконами и всевозможной утварью. В их изготовлении, так же как и в строительстве, принимали участие и местные монастырские мастера. В частности, иконописец монах Александр выполнил в 1585 году роспись Святых ворот. Но больше всего местные иконники писали небольшие образа для раздачи богомольцам. В начале XVII века около монастыря находился отдельный двор, где жили иконники, серебряники и другие ремесленники, работавшие на монастырь.
Монастырь был не только местом сосредоточения художественной деятельности, но и центром культурной жизни в более широком понимании. Еще при основателе монастыря Кирилле положено было начало собиранию и переписке книг. В монастыре долгое время работала книгописная мастерская, оставившая богатое наследство. Часть книг не только переписана, но и создана в Кириллове, в частности, Кирилловский летописец, содержащий ценные сведения об истории монастыря и некоторые полемические произведения. Активный участник книгописания Гурий Тушин собственноручно переписал 37 книг, большая часть которых дошла до нашего времени. В кирилловском книжном собрании, обширном и разнообразном по составу, хранились книги и светского содержания. Из кирилловской библиотеки происходит древнейший список "Задонщины" - произведения, посвященного описанию Куликовской победы. Ценнейшая кирилловская рукописная коллекция в конце XIX века передана в Санкт-Петербург в Императорскую Публичную библиотеку, где хранится и сейчас.