Новый метод хроматографии на бумаге оказался на редкость эффективным. Он прост и дешев, не требует сложной аппаратуры, позволяет тщательно разделять ничтожные количества компонентов смеси. Метод получил широкое применение во всех областях биохимии. Им, в частности, воспользовался Кэлвин в своих экспериментах со смесью фотосинтезирующих растительных клеток. По существу, исследования без применения метода хроматографии на бумаге стали немыслимы. С его помощью появилась возможность установить точное количество различных аминокислот того или иного белка. Это в свою очередь позволило определить аминокислотный состав одного белка за другим, подобно тому как устанавливают число атомов различных элементов, входящих в то или иное соединение.

Но всего этого оказалось недостаточно. Как известно, химиков интересует не только число атомов в любом соединении, но и их расположение. То же относится и к аминокислотам в молекуле белка. Вопрос о расположении аминокислот сложен. Даже если в молекуле всего несколько десятков аминокислот, число возможных сочетаний астрономически велико, а если их больше 500 (как, например, в гемоглобине, где молекула средней величины), число возможных расположений выражается цифрой из 600 знаков. Как же из такого невообразимого числа возможностей правильно выбрать наиболее вероятное расположение аминокислот каждого конкретного белка?

Оказалось, что с помощью метода хроматографии на бумаге эта проблема разрешается очень легко. Однако английскому биохимику Фредерику Сэнгеру (род. в 1918 г.) понадобилось восемь лет, чтобы исследовать этим методом молекулу инсулина, состоящую всего из 50 аминокислот! Сэнгер расщеплял молекулу на части, методом хроматографии на бумаге разделял короткие цепи и определял слагающие их аминокислоты, а также порядок расположения последних. Это было нелегкой задачей, ибо даже четырехкомпонентный фрагмент может располагаться 24 различными способами. Выявив, каким более коротким цепям дают начало длинные цепи, Сэнгер мало-помалу воссоздал структуру более длинных цепей. К 1953 г. он уже знал точный порядок аминокислот в молекуле инсулина.

Рис. 6. Химическая формула, показывающая сложную структуру белка.

Выше изображена часть одной из двух пептидных цепей, которые образуют молекулу инсулина. Полипептидный скелет повторяется по центру цепи, образованной связанными аминокислотами и их различными боковыми цепями. Ниже изображен пептид, содержащий три аминокислоты, R — боковые аминокислотные цепи.

Вслед за Сэнгером его методом воспользовался американский биохимик Винсент Виньо (род. в 1901 г.). Он применил его к очень простой молекуле окситоцина (гормона задней доли гипофиза), состоящей всего из восьми аминокислот. Установив расположение аминокислот, Виньо попытался синтезировать соединение таким образом, чтобы каждая аминокислота находилась на полагающемся ей месте. Синтез был осуществлен в 1955–1956 гг.; полученный в результате синтетический окситоцин по своим свойствам не уступал природному гормону. Аналитический метод Сэнгера, равно как и синтез Виньо, впоследствии был повторен в более широком масштабе. В 1960 г. ученые установили расположение аминокислот в ферменте, названном рибонуклеазой. Молекула рибонуклеазы состоит из 124 аминокислот, это в два с половиной раза превышает число аминокислот в молекуле инсулина. Фрагменты рибонуклеазы синтезировали, после чего изучали их ферментативную активность. Таким образом, к 1963 г. удалось установить, что для функционирования молекулы существенно необходимы аминокислоты 12 и 13 (гистидин и метионин). Это было значительным шагом вперед в определении точного механизма функционирования молекулы фермента.