Успенский собор впервые был полностью расписан в 1513–1515. Однако отдельные композиции, скорее всего, появились раньше этой даты. Сохранившиеся в алтарной части храма фрески датируют концом XV — началом XVI века. На каменной алтарной преграде, в нижнем ярусе иконостаса, можно видеть изображения, по-видимому, созданные после 1481 знаменитым Дионисием и его сподвижниками.

Новая роспись выполнена в 1642–1643 согласно указу царя Михаила Федоровича большой (около ста пятидесяти человек) артелью жалованных и кормовых иконописцев из Москвы и целого ряда русских городов во главе с царскими изографами Иваном и Борисом Паисеиными и Сидором Поспеевым. Старые изображения были скопированы, роспись по новому левкасу исполнена с сохранением прежней композиции в технике фрески, а потом прописана темперой по сухой штукатурке. Высокий художественный уровень исполнения царского заказа способствовал тому, что роспись Успенского собора послужила образцом для создания подобных циклов во многих храмах и соборах России.

Фресковый цикл Успенского собора — это большая, хорошо продуманная богословская программа. Здесь представлена история человечества, отраженная в Священном Писании. Расположение сюжетов отвечает представлению о храме как модели Вселенной, с разделением пространства на мир дольний и мир горний. Наверху располагаются наиболее значимые изображения: в центральном куполе — Спас Вседержитель, на парусах — четыре евангелиста, на подпружных арках — апостолы, на сводах — самые существенные эпизоды земной жизни Иисуса Христа и Богоматери.

На четырех круглых опорах помещены фигуры ста тридцати пяти мучеников, почитавшихся как «столпы Церкви». На стенах композиции размещаются ярусами в виде широких, разделенных цветными полосами лент. Здесь представлены богородичные циклы: сцены из Жития Богоматери и Акафиста. В нижней части показаны «Семь вселенских соборов», то есть съезды высших церковных иерархов, проходившие в IV–VII веках, на которых были утверждены главные христианские догматы. Отдельная композиция на западной стене посвящена Страшному суду, который произойдет, по мнению христиан, после второго пришествия Христа.

Древнейшая из находящихся в Успенском соборе икон, по-видимому, была привезена из Новгорода Великого во времена Ивана Грозного и начиная с XVI века размещалась в иконостасе этого главного кремлевского собора. Двусторонняя икона помещена в вертикальной витрине у северной стены. На ее главной стороне представлен образ Богородицы Одигитрии. Во время раскрытия в 1995 Георгием Сергеевичем Батхелем этого образа от поздних записей были обнаружены фрагменты живописи, относящиеся к XI–XIX векам. Первоначальный красочный слой сохранился только на шее и руке Младенца. Большая часть иконы была переписана заново в XIV веке греческим иконописцем.